プレスリリース タンパク質の抗体ラベリング技術を改良し、構造解析をアシスト―電子顕微鏡やX線結晶解析による構造決定を加速化―

横浜市立大学
筑波大学
大阪大学
京都大学
東北大学
日本医療研究開発機構

横浜市立大学 大学院生命医科学研究科の禾 晃和准教授らは、筑波大学、大阪大学蛋白質研究所、京都大学、東北大学との共同研究で、タンパク質に外来の抗原配列を移植して抗体を結合させる技術を開発しました。本技術によって、これまで直接結合する抗体がなかったタンパク質に抗体を結合させることが可能になり、X線結晶解析^*1や電子顕微鏡単粒子解析^*2で立体構造情報が明らかになる可能性があります。

本研究成果は、科学誌「Acta Crystallographica Section D, Structural Biology」に掲載されます。（英国夏時間 2021年4月19日午前9時掲載）

研究成果のポイント

• 標的タンパク質の立体構造を壊さずに抗原配列を移植し、抗体を結合させてラベリングできる技術を開発した

• 抗体ラベリング^*3の適用拡大で、電子顕微鏡やX線結晶解析による構造決定の可能性も広がった

タンパク質の立体構造解析は、生命現象の解明だけでなく、創薬においても非常に重要な研究手法です。その解析において、抗体は有用な実験ツールとして用いられてきました。特にタンパク質の抗体によるラベリングは、X線結晶解析では、結晶になりにくいタンパク質の結晶化を促進させる効果があり、電子顕微鏡解析では、コントラストが低い画像から標的タンパク質を見つけ出す目印として役立ちます。しかしながら、抗体でラベリングを行うには、標的タンパク質を直接認識する抗体があることが前提で、適用範囲は限られていました。

この課題に対し、禾准教授らは新たな抗体ラベリング技術の開発に取り組んできました。これまでに、「PAタグ」と呼ばれる12残基のアミノ酸配列を標的タンパク質に移植し、このPAタグと強固に結合するNZ-1抗体でラベリングする技術を開発しました（図1）。このPAタグの移植部位を最適化することで、標的タンパク質にNZ-1抗体が安定に結合することが示されましたが、PAタグの移植やそのNZ-1抗体との結合によって標的タンパク質の一部の構造が変化してしまうことも明らかになっていました。

そこで今回の研究では、タグの長さを伸ばすことで移植した際の標的タンパク質の構造変化を抑えることを試みました。その結果、PAタグのN末端側にアミノ酸残基を2つ付け加えたPA14タグでは、標的タンパク質を天然の構造に近い状態に維持できることが示されました。

標的タンパク質にPA14タグを移植してX線結晶解析を行ったところ（図2）、PA14タグはNZ-1抗体と結合すると末端同士が近づいてリング状の構造をとること（図3）、そしてNZ-1抗体が結合しても標的タンパク質の立体構造がほとんど壊れないことが確かめられました（図4）。さらに分子動力学シミュレーション^*4からも、PA14タグを移植した標的タンパク質の構造が安定に維持されることを確認しました。そして、PA14タグを細胞膜の中で働くタンパク質に移植し、NZ-1抗体を結合させて負染色電子顕微鏡解析^*5を行うことで、標的タンパク質の構造情報を取得することにも成功しました（図5）。

今回の研究から、PA14タグは標的タンパク質に移植して抗体を結合させるのに適した配列であることが確かめられましたが、その一方で、標的タンパク質に結合したNZ-1抗体の向きが完全には固定されず、揺らぐ場合があることも分かりました。今後、標的タンパク質の構造は壊さずに抗体の向きを固定できるようになれば、クライオ電子顕微鏡などを用いて精密に立体構造を調べることが可能になると期待されます。

タイトル
Moving toward generalizable NZ-1 labeling for 3D structure determination with optimized epitope tag insertion

著者
Risako Tamura-Sakaguchi, Rie Aruga, Mika Hirose, Toru, ekimoto, Takuya Miyake, Yohei Hizukuri, Rika Oi, Mika K. Keneko, Yukinari Kato, Yoshinori Akiyama, Mitsunori Ikeguchi, Kenji Iwasaki, Terukazu Nogi

掲載雑誌
Acta Crystallographica Section D, Structural Biology

DOI
10.1107/S2059798321002527

※本研究は、日本学術振興会科研費、国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）創薬等ライフサイエンス研究支援基盤事業（BINDS）、横浜市立大学 学術的研究推進事業 研究奨励プロジェクトの助成を受けて実施されました。

*1　 X線結晶解析
結晶化した物質にX線を照射して回折パターンを解析し、立体構造情報を取得する研究手法。タンパク質のような巨大な分子でも結晶化すれば、解析が可能になる。

*2　電子顕微鏡単粒子解析
タンパク質試料に電子線を照射して撮影した透過像から立体構造情報を取得する技術。重金属塩を満たしてタンパク質に浸潤させ形状を解析する負染色電子顕微鏡法^*5とタンパク質を薄い氷の中に閉じ込めて構造を解析するクライオ電子顕微鏡法が代表的な解析手法である。

*3　 抗体ラベリング
標的となるタンパク質に抗体を結合させる技術。立体構造解析で利用する際は、抗原結合部位を含む抗体の一部分を結合させる場合が多い。

*4　分子動力学シミュレーション
計算機シミュレーションの１つで、分子を構成する各原子の運動を解析する研究手法。実験的に観測が難しい、分子の動的な性質を解析することが可能となる。

*5 負染色電子顕微鏡解析
タンパク質などの生体試料を重金属塩で染色すると、試料の隙間や周囲に重金属塩が浸潤する。染色後の試料に電子線を照射すると、主に電子散乱能の大きい重金属塩が形成するコントラストにより間接的にタンパク質など生体試料の形状を観察できる。透過像で実際に観察しているのは重金属塩の分布であることから負染色と呼ばれる。

横浜市立大学 大学院生命医科学研究科
准教授 禾 晃和
教授 池口 満徳
助教 浴本 亨

筑波大学生存ダイナミクス研究センター
教授 岩崎 憲治
大阪大学 蛋白質研究所
特任研究員（常勤） 廣瀬 未果

京都大学 ウイルス・再生医科学研究所
教授 秋山 芳展
助教 檜作 洋平

東北大学 大学院医学研究科
教授 加藤 幸成

PAタグを利用した抗体ラベリング技術の開発の先行研究に関する論文

タイトル
Application of the NZ‐1 Fab as a crystallization chaperone for PA tag‐inserted target proteins

著者
Risako Tamura, Rika Oi, Satoko Akashi, Mika K. Keneko, Yukinari Kato, Terukazu Nogi

掲載雑誌
Protein Science (2019) 28, 823-836

DOI
10.1002/pro.3580

研究成果に関する窓口

横浜市立大学 大学院生命医科学研究科
准教授 禾 晃和
Tel：045-508-7226
E-mail：nogi“AT”yokohama-cu.ac.jp

取材対応に関する窓口

横浜市立大学 広報室
担当課長 上村 一太郎
Tel：045-787-2414
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筑波大学 広報室 報道担当
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大阪大学 蛋白質研究所 広報室
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東北大学 大学院医学系研究科・医学部広報室
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