プレスリリース 再生医療用の移植細胞中に混在するがん細胞を超高感度に検出する方法を開発―正常細胞中に1000万分の1の割合で混入するがん細胞の検出に成功―

国立医薬品食品衛生研究所
国立研究開発法人日本医療研究開発機構

国立医薬品食品衛生研究所（川西徹所長）は、日本医療研究開発機構（AMED）（末松誠理事長）および先端医療振興財団（本庶佑理事長）との共同研究により、再生医療用の移植細胞の製造中に混入または発生するがん化のリスクを持つ悪性形質転換細胞（がん細胞）を超高感度に検出する方法「デジタル軟寒天コロニー形成試験法」を開発しました。そして、この試験法を用い、正常細胞中に1000万分の1の割合で混入するがん細胞を検出することに成功しました。本試験法は、再生医療用の移植細胞の製造工程管理において、有害不純物としてのがん細胞の混入を否定する試験として有用であり、製品の品質・安全性の確保に資することが期待されます。

この研究は国立医薬品食品衛生研究所 再生・細胞医療製品部の佐藤陽治部長とAMEDリサーチ・レジデントの草川森士博士を中心としたグループによって進められました。本研究成果は、英国科学雑誌“Scientific Reports”に2015年12月8日10時（日本時間12月8日19時）にオンライン掲載されました。

再生医療に用いられる移植細胞の製造における大きな懸念の一つに、細胞サンプルが誤って混ざってしまうリスク（クロス・コンタミネーションのリスク）があります。中でも移植細胞の製造工程において、がん細胞が混ざってしまうことは、再生医療用の移植細胞の安全性確保の上で重要な問題となります。このような問題に対処するため、移植細胞の製造工程管理において、有害不純物としてのがん細胞の存在を否定し、移植細胞の品質を確保する方策が求められます。

がん細胞の特性の一つである足場非依存性増殖を利用する軟寒天コロニー形成試験は、正常細胞中に混入する悪性形質転換細胞の存在を比較的短期間かつ簡便に評価することが可能な試験です（図1）。しかしながら、従来のアッセイ法による検出感度は低く、正常細胞中に微量に混入させたがん細胞から形成されるコロニーを検出することは困難という問題がありました。そこで、我々はがん細胞混入の高感度検出を目的とし、軟寒天コロニー形成試験におけるコロニー検出のための新たなシステムの構築に取り組んできました

従来の軟寒天コロニー形成試験では、形成された1個のコロニーを精度良く検出することは不可能でした。そこで、本研究では画像解析によるコロニー検出法の確立を試みました。その結果、細胞の核、ミトコンドリアをそれぞれ青、赤に染める生細胞染色試薬を用いてコロニーを染色し、コロニーの形状、大きさ、蛍光輝度等を指標とすることで、1個のコロニーを高精度に認識することが可能となりました（図2）。さらに、ハイコンテンツイメージングシステム（→用語解説参照）を利用することで、画像解析のハイスループット化（大量迅速処理）にも成功しました。

次に、この技術を応用し、再生医療用の移植細胞中に混在するがん細胞の新たな検出法、デジタル軟寒天コロニー形成試験を考案しました（図3）。デジタル軟寒天コロニー形成試験は、細胞試料をマルチウェルプレートに分割、播種して軟寒天培養を行い、各ウェル内での細胞コロニー形成を解析し、足場非依存的に増殖するがん細胞の混入を評価する手法です。この試験法は、大量の細胞からなる試料であっても、複数に分割したウェル毎にコロニー形成の有無を解析するため、高シグナル／ノイズ比が確保され、試料中にごく微量に存在するがん細胞を高感度に検出することが可能となります。また、ハイコンテンツイメージングシステムを利用した解析を行うことで、画像解析のハイスループット化も可能と考えました。

本試験法の実行可能性を検証するため、1000万個のヒト正常細胞（ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞）中に1個のがん細胞（HeLa細胞＝株化されたヒト子宮頸がん細胞）を混入させた試料を、96ウェルプレート2枚の計160ウェルに分画し軟寒天培養を行いました。培養30日後に、細胞の染色・固定処理を施し、コロニーの解析を試みました。ハイコンテンツイメージングシステムを利用し、各ウェルの画像の取得、解析を、高速かつ効率的に行った結果、1000万個のヒト間葉系幹細胞中に存在する1個のHeLa細胞由来のコロニーを6回の試行中4回検出することに成功しました（図4）。この結果は、HeLa細胞相当のがん細胞が混入する細胞試料であれば、本試験法によって0.00001％の感度で検出可能であることを示唆するものであり、従来の手法による検出感度と比較して1万倍の感度向上を実現させました。また、細胞試料を分画、播種するウェル数及び培養細胞数を調節することで、検出感度を適宜向上させることが可能であることに加え、細胞数にかかわらず、高検出感度を保持する本試験法の適用が可能であることも考えられます。

デジタル軟寒天コロニー形成試験を用いることにより、従来の手法と比べ1万倍向上させた世界最高感度の検出力（0.00001％混入細胞を検出）をもって正常細胞中のがん細胞の混入を評価することが可能となりました。また、大量の細胞からなる製品の評価にも適用可能な本試験法は、再生医療用の移植細胞の品質・安全性の確保に大きく貢献できると期待されます。（なお、デジタル軟寒天コロニー形成試験では正常細胞中に混在する未分化iPS／ES細胞（←がん細胞ではない）の検出はできない点、ご注意ください）

今後は、再生医療用の移植細胞の製造工程における品質評価のための標準的な試験系にすることを目指し、試験系の自動化等もふまえ、試験方法の最適化に向けた研究を進めていきます。

本研究は、国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）の再生医療実用化研究事業における研究課題「特定細胞加工物／再生医療等製品の品質確保に関する研究」（分担研究代表者：佐藤陽治 国立医薬品食品衛生研究所 再生・細胞医療製品部長）の一環として行われました。また、AMEDの若手研究者育成活用事業（リサーチ・レジデント育成活用事業）の支援も受けております。

悪性形質転換細胞（がん細胞）は足場非依存的増殖性を有するため、軟寒天培地中でコロニーを形成する。一方、正常な細胞はコロニーを形成しない。

ヒト間葉系幹細胞にHeLa細胞（株化されたヒト子宮頸がん細胞）を混入させた試料を軟寒天培養した結果、HeLa細胞由来のコロニー形成が観察された。生細胞染色蛍光色素を用い、細胞のミトコンドリア、核をそれぞれ赤と青に染色した。コロニーの形状、大きさ、蛍光輝度等を指標とする画像解析によって、コロニーを高精度に検出することが可能となる。

正常細胞中にごく微量に混入する悪性形質転換細胞（がん細胞）を検出する方法

細胞試料は160個のウェルに分画され、ウェルごとにコロニーの有無を解析した。ミトコンドリア染色像、核染色像を利用した画像解析によりコロニーが検出された。

ハイコンテンツイメージングシステム

生細胞や固定細胞の蛍光又は明視野画像シグナルを用いて、細胞の形態や細胞内分子の発現・局在変化などを定量化するシステム。顕微鏡を備えた撮像装置および画像解析ソフトウェア等で構成される。マルチウェルプレートの解析を高速に連続的に行うことが可能。

論文情報

タイトル（訳）：Ultra-sensitive detection of tumorigenic cellular impurities in human cell-processed therapeutic products by digital analysis of soft agar colony formation（デジタル軟寒天コロニー形成試験による特定細胞加工物／再生医療等製品中の造腫瘍性細胞の超高感度検出）

著者：草川 森士、安田 智、黒田 拓也、川真田 伸、佐藤 陽治

雑誌名：Scientific Reports

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